تولید ماست فراسودمند غنی شده با نانوحامل لیپوزومی حاوی بخش پپتیدی به دست آمده از جلبک گراسیلاریا کورتیکاتا

در گذشته مطالعات متعدد به منظور تولید مواد غذایی فراسودمند با استفاده از نانوحامل های لیپوزومی صورت گرفته است. همچنین مطالعات جدید که در بخش مروری بر منابع گذشته درج شده است به بررسی پروتئین هیدرولیز شده (پپتید) جهت غنی سازی محصولات غذایی پرداخته است که یکی از منابع مورد بررسی جلبک می باشد. مشکل این مطالعات این بود که بر روی گونه ای از جلبک مطالعه نموده اند که درصد پروتئین زیادی نداشت. اما جلبک مورد مطالعه در این پژوهش حاوی درصد بالایی از پروتئین می باشد و لذا استخراج پپتید از این جلبک مقرون به صرفه می باشد. لذا هدف از این مطالعه جمع آوری، شناسایی و استخراج پپتیدهای زیست­فعال موجود در گونه جلبک گراسیلاریا کورتیکاتا می­باشد. در ادامه ترکیبات فراسودمند مذکور در نانوحامل لیپوزومی بارگزاری خواهند شد. همچنین رهایش ترکیبات مذکور در مدل هضم (شامل معده و روده) نیز بررسی و سنتیک رهایش مورد مطالعه قرار می­گیرد. در نهایت هدف اصلی طرح غنی سازی محصول لبنی (ماست) با این نانوحامل و بررسی خصوصیات فیزیکوشیمیای آن می باشد.

In the past, numerous studies have been conducted to produce functional foods using liposomal nanocarriers. Also, new studies included in the review of past sources have investigated hydrolyzed protein (peptide) for enriching food products, which is one of the sources studied algae. The problem with these studies was that they studied a species of algae that did not have a high protein percentage. However, the algae studied in this study contains a high percentage of protein, and therefore extracting peptides from this algae is cost-effective. The aim of this study is to collect, identify and extract bioactive peptides present in the algae species Gracilaria corticata. Subsequently, the functional compounds mentioned will be loaded into liposomal nanocarriers. Also, the release of the mentioned compounds in the digestion model (including stomach and intestine) will be investigated and the release kinetics will be studied. Finally, the main aim of the project is to enrich the dairy product (yogurt) with this nanocarrier and investigate its physicochemical properties.

امروزه، تمرکز فزآینده­ای به منظور توسعه مواد غذایی کاربردی، که به طور خاص به منظور افزایش سلامت و رفاه انسان طراحی شده­اند، وجود دارد (Hosseini et al., 2021). در این میان، موجودات دریایی، نیمی از کل تنوع زیستی جهانی را شامل می­شوند. در میان موجودات دریایی، علف­های دریایی[1] از دسته ماکروجلبک­ها می­باشند که از نظر بیولوژیکی عمدتا بر اساس ترکیبات رنگدانه­ای آنها به سه دسته فئوفیتا[2] (علف­های قهوه­ای)، ردوفیتا[3] (علف قرمز) و کلروفیتا[4] (علف سبز)، دسته­بندی می­شوند. اغلب کشورها، به طور سنتی از جلبک­ها به عنوان بخشی از غذا استفاده می­کنند (Savaghebi et al., 2020).علف­های دریایی حاوی ریز مغذی­ها و مولکول­های فعال زیستی نیز می­باشد. با توجه به محتوای پروتئینی، فراوانترین آمینو اسیدها در گونه­های گراسیلاریا کورتیکاتا عبارتند از اسید آسپارتیک، آلانین، گلوتامیک اسید و گلوتامین.این آمینو­اسیدها طعم معمولی جلبک ها را ارائه می­دهند و در پاسخ به شرایط استرس محیطی تولید می­شوند (Rosemary et al., 2019).پپتیدهای زیست­فعال گروه مهمی از ترکیبت زیست­فعال می­باشند که امروزه در صنایع غذایی و دارویی به ویژه در فرمولاسیون­های غذایی بسیار کاربرد دارد. لذا لزوم استخراج این ترکیب زیستی از علف­های دریایی به ویژه گونه گراسیلاریا که منبع مهم این ترکیبات است و به وفور در سواحل چابهار یافت می­شود و کمک شایان توجهی به صنعتگران امر غذا می­نماید (Raja et al., 2020). یکی از منابع مهم تولید ترکیبات زیست­فعال، پروتئین­ها می­باشند. پروتئین­ها علاوه بر­ داشتن کیفیت و ارزش غذایی، دارای فاکتورهای مهم دیگری منجمله مزایای عملکردی و سلامتی بخشی می­باشند. اما حساسیت و بی­ثباتی پروتئین­ها و ترکیبات مبتنی بر پروتئین به عوامل محیطی، حلالیت، محدودیت­های هضمی، وجود برخی از ترکیبات حساسیت زا و از بین رفتن ویژگی­های عملکردی در نتیجه واکنش با سایر ترکیبات، توانایی استفاده طبیعی از این ترکیبات را کاهش می­دهد (Sarabandi et al., 2019).

یکی از مهمترین روش­ها برای اصلاح ساختاری و تولید پپتیدهای فعال زیستی، هیدرولیز آنزیمی است. شکستن پیوندهای پپتیدی در طی هیدرولیز آنزیمی منجر به آزاد شدن پپتیدهای فعال در توالی اولیه پروتئین­ها می­شود. پپتیدهای فعال زیستی، قطعات پروتئینی با وزن مولکولی کم از 2-20 باقیمانده اسید آمینه می باشند که موجودیت زیستی آنها تحت تأثیر ترکیب و توالی اسیدهای آمینه آن­ها می­باشد (Xie et al., 2019). مزایای این ترکیبات در مقایسه با آنتی­اکسیدان­های سینتیک، مزایای سلامتی­بخش و نقش آنها در کاهش و درمان بیماری­های مختلف در مطالعات مختلف تأیید شده است. هزینه کم تولید، قابلیت هضم بالا، جذب آسان، ایمنی، آلرژی زایی کم، حفظ فعالیت، پایداری بیشتر در شرایط و فرمول­های مختلف، ارزش غذایی بالا و ویژگی­های عملکرد زیستی از مزایای اصلی پپتیدهای فعال زیستی در مقایسه با آنتی­اکسیدان ها و ترکیبات مصنوعی است (Akbarbaglu et al., 201بررسی اثرات سمی پپتیدها به معنای مطالعه و ارزیابی تأثیرات مضر و سمی پپتیدها بر سلول‌ها، بافت‌ها یا موجودات زنده است. این بررسی می‌تواند شامل مطالعه سمیت حاد (اثرات کوتاه‌مدت و شدید) و یا سمیت مزمن (اثرات طولانی‌مدت) باشد. هدف از این بررسی‌ها، تعیین غلظت‌های سمی پپتیدها و درک مکانیسم‌های سمی بودن آنهاست.اثرات سمی پپتیدها می‌تواند شامل موارد زیر باشد: آسیب سلولی: پپتیدها می‌توانند با آسیب رساندن به غشای سلولی، اختلال در عملکرد اندامک‌های سلولی، یا تداخل در فرآیندهای متابولیکی، باعث مرگ سلولی شوند. سمیت ژنتیکی: برخی پپتیدها ممکن است باعث آسیب به DNA یا ایجاد جهش در سلول‌ها شوند که می‌تواند منجر به سرطان یا سایر بیماری‌های ژنتیکی شود (Khan et al., 2018).).

از مهمترین معایب پپتیدها می­توان آبدوستی زیاد این ترکیبات، موجودیت زیستی و زیست پایداری پایین، درجه تلخی زیاد، ناسازگاری و بی ثباتی فیزیکوشیمیایی به عوامل ناپایداری محیطی مانند دما، نور، pH، قدرت یونی، یونهای فلزی و عوامل اکسید­کننده یا کاهنده اشاره نمود (Akbarbaglu et al., 2019).

با توجه به معایب مذکور، طراحی و توسعه تکنیک­های میکرو/نانو کپسوله­سازی به منظور حفاظت از ترکیبات زیست­فعال در برابر شرایط نامناسب محیطی، عوامل ناپایدار، واکنش دهنده­ها، بهبود زیست­سازگاری، پوشش­دهی تلخی و انتشار هدفمند از اهداف مهم محققین می­باشد یک استراتژی موثر برای غلبه بر مشکل استفاده از تکنیک ریزپوشانی می­باشد. در میان روش­های میکروکپسولاسیون، نانولیپوزو­ها، پایداری و راندمان انکپسولاسیون بهتری نسبت به روش­های متداول انکپسولاسیون تولید می­کنند. نانولیپوزوم­ها، ساختارهای خود تشکیل شونده­ای هستند که از کنار هم قرار گرفتن مولکول­های لیپیدی، در محلول آبی حاصل می­شوند (Zhang et al., 2021). توانایی این نانوساختارها در کپسوله نمودن مقدار زیاد ترکیبات مغذی و دارویی، به حداقل رساندن عوارض جانبی ناخواسته، اثربخشی بالا و سمیت پایین توانسته علاقه محققین را به این نانو ساختار جلب کندنانولیپوزوم­ها، ساختارهای خود تشکیل شونده­ای هستند که از کنار هم قرار گرفتن مولکول­های لیپیدی، در محلول آبی حاصل می­شوند (Zhang et al., 2021). توانایی این نانوساختارها در کپسوله نمودن مقدار زیاد ترکیبات مغذی و دارویی، به حداقل رساندن عوارض جانبی ناخواسته، اثربخشی بالا و سمیت پایین توانسته علاقه محققین را به این نانو ساختار جلب کند. مولکلولهای چربی دوست فسفولیپید، به گونه ای در کنار هم قرار می گیرند که، گروهای آب گریزشان به سمت داخل کره و گروه های آب دوستشان به سمت خارج کره جهت گیری کرده باشد. به این ترتیب یک غشای کروی دولایه تشکیل می شود. این نحوه جهت گیری، امکان بارگیری داروهای آب دوست در هسته، و داروهای آب گریز در پوسته لیپوزوم ها را امکان پذیر می سازد. اولین بار لیپوزوم توسط آلک بنگهام در سال 1960 کشف و معرفی شد.او لیپوزوم ها را وزیکولهای چند جداره متشکل از ترکیبات لیپیدی می- دانست که در یک محیط آبی پراکنده هستند. بعدها این ساختمان، لیپوزوم نامگذاری شد (García-Morales et al., 2025)..

ماست یکی از محصولات لبنی است که به دلیل داشتن باکتری‌های مفید و ترکیبات زیست فعال، فواید زیادی برای سلامت انسان دارد. ماست منبع خوبی از پروتئین، کلسیم و ویتامین‌ها است و می‌تواند به تقویت سیستم ایمنی، بهبود هضم و کاهش خطر بیماری‌های مزمن کمک کند. علاوه بر این، ماست می‌تواند به عنوان یک حامل مناسب برای ترکیبات زیست فعال مانند پروبیوتیک‌ها، ویتامین‌ها و مواد معدنی مورد استفاده قرار گیرد. با افزودن پپتیدهای زیست فعال به ماست، می‌توان ارزش غذایی آن را افزایش داد و فواید بیشتری برای سلامت انسان فراهم کرد. برای مثال، افزودن این ترکیبات به ماست می‌تواند به بهبود سلامت روده و تقویت سیستم ایمنی کمک کند. محصولات لبنی به ویژه ماست با وجود دارا بودن پروتئین دارای دو مشکل اساسی است. طبق مطالعات تغذیه ای، بخشی از پروتئین های ماست قابل جذب برای انسان نمی باشد. دوم اینکه پپتیدها بر خلاف پروتئین ها خصوصیات تغذیه ای بسیار مناسبتری دارند و پروتئین های لبنی قادر به فراهم نمودن این بخش از خصوصیات تغذیه ای برای انسان نمی باشدبنابراین، غنی سازی ماست با ترکیبات زیست فعال می‌تواند یک راه موثر برایبهبود ارزش غذایی و فواید سلامتی آن باشد.

در گذشته مطالعات متعدد به منظور تولید مواد غذایی فراسودمند با استفاده از نانوحامل های لیپوزومی صورت گرفته است. همچنین مطالعات جدید که در بخش مروری بر منابع گذشته درج شده است به بررسی پروتئین هیدرولیز شده (پپتید) جهت غنی سازی محصولات غذایی پرداخته است که یکی از منابع مورد بررسی جلبک می باشد. مشکل این مطالعات این بود که بر روی گونه ای از جلبک مطالعه نموده اند که درصد پروتئین زیادی نداشت. اما جلبک مورد مطالعه در این پژوهش حاوی درصد بالایی از پروتئین می باشد و لذا استخراج پپتید از این جلبک مقرون به صرفه می باشد.لذا هدف از این مطالعه جمع آوری، شناسایی و استخراج پپتیدهای زیست­فعال موجود در گونه جلبک گراسیلاریا کورتیکاتا می­باشد. در ادامه ترکیبات فراسودمند مذکور در نانوحامل لیپوزومی بارگزاری خواهند شد. همچنین رهایش ترکیبات مذکور در مدل هضم (شامل معده و روده) نیز بررسی و سنتیک رهایش مورد مطالعه قرار می­گیرد. در نهایت هدف اصلی طرح غنی سازی محصول لبنی (ماست) با این نانوحامل و بررسی خصوصیات فیزیکوشیمیای آن می باشد.

مروری برمنابع گذشته

اعتمادی و همکاران(1393)، فعالیت شلاته کنندگی و قدرت احیاء کنندگی پروتئین‌های هیدرولیز شده‌‌ی سویا را بررسی کردند و دریافتند که، بیشترین درجه هیدرولیز در دمایC°55، زمان 210 دقیقه و نسبت آنزیم به سوبسترای %90(وزنی/ وزنی)، حاصل شده و تحت این شرایط فعالیت شلاته کنندگییونفرو در حداکثر مقدار خود می‌باشد.

شعبانپور و همکاران(1393)، ایزوله‌ی پروتئینی ضایعات میگوی ببری سبز را با آنزیم فلاورزایم هیدرولیز کردند و دریافتند که تیمار در دمایC°06/54و نسبت آنزیم به سوبسترا %61/1 (وزنی / وزنی)، زمان 8/105 دقیقه و درجه هیدرولیز% 5/33 دارای بالاترین قدرت آنتی اکسیدانی می‌باشد.

پیری قشلاقی و همکاران(1394)، هیدرولیز ایزوله پروتئین آب پنیر را با آنزیم آلکالاز بررسی کردند و بالاترین فعالیت شلاته کنندگی را در دمایC°50، نسبت آنزیم به سوبسترای%60 (وزنی / وزنی) و زمان هیدرولیز 90 دقیقه گزارش کردند.

پارک و همکاران(2001)، هیدرولیز ایزوله‌یپروتئینی لستین زرده تخم مرغ را با آنزیم آلکالاز ارزیابی کردند و با مقایسه‌ی قدرت آنتی اکسیدانی پپتید‌های حاصل با α-توکوفرول، دو پپتید متفاوت با بیشترین فعالیت آنتی اکسیدانی را شناسایی و گزارش کردند که آنها حاوی 10-5 آمینواسید بوده و دارای لوسین در انتهایN-ترمینال خود هستند.

ملاویسی و همکاران (2021) به بررسی اثر عصاره گیاه سرخارگل[1] انکپسوله شده در قالب نانوفیتوزوم به داخل یک نوشیدنی اسیدی غذایی پرداختند. نتایج این مطالعه نشان داد که پایداری و خاصیت آنتی اکسیدانی این عصاره در محیط اسیدی این نوشیدنی تا 30 روز حفظ شد.

ناظمیه و همکاران (2016) موفق به انکپسوله کردن کورکومین در نانوذرات جامد لیپدی[2] شدند. نتایج این تحقیق نشان داد که انکپسوله کردن لیکوپن در قالب ماتریکس مذکور سبب پایداری و عدم افزایش ذرات در محلول های آبی تا مدت 2 ماه شد.

شارما[3] و همکاران (2016) از نانوحامل نیوزومی به منظور انکپسولاسیون لیکوپن استفاده نمودند و در ادامه خاصیت ضدسرطانی پودر کپسوله شده را بررسی نمودند. نتایج این مطالعه از اثرات موفقیت آمیز لیکوپن انکپسوله شده در ساختار فیتوزومی بر ضد سلول های سرطانی حاکی بود.

قنبرزاده و همکاران (2016) به بررسی اثر غلظتهای مختلف لستین- کلسترول بر خصوصیات اندازة ذرات، پتانسیل زتا، کارایی و پایداری درونپوشانی نانولیپوزوم های حامل ویتامین A پالمیتات پرداختند. نتایج این مطالعه نشان داد که اندازه ی ذرات در محدودة 76-115 نانومتر و توزیع اندازه ی ذرات باریک و تک مد (اسپن = 88/0 - 6/0) بود. افزودن کلسترول اثر معنی داری بر اندازه ی ذرات نشان نداد ولی مقادیر زیاد کلسترول موجب کاهش کارایی درونپوشانی گردید. با ورود کلسترول و همچنین ویتامین به ساختار نانولیپوزوم، پتانسیل زتا از 29 - به 58 – میلی ولت افزایش یافت که نشان دهنده ی بهبود پایداری الکترواستاتیک نانولیپوزوم ها بود. در کل، غلظت 50 به 10 میلی گـرم لسـتین به کلسترول، به عنوان غلظت مناسب در تولید فرمولاسیون بهینه نانولیپوزوم ها با توزیع ذره یکنواخت و تک مد (اسـپن = 74/0) وکـارایی درون پوشـانی 8/15% شناخته شد.

نوری (2020) به تهیه تهیه نانولیپوزومهای حاوی عصاره های زوفا و چوچاق و بررسی اثرات آنتی اکسیدانی و ضد میکروبی آنها پرداخت. در این مطالعه، نانولیپوزومهای حاوی عصاره چوچاق به طور معنی داری ظرفیت بارگذاری (5/17%) و بازده درون پوشانی (5/23%) بیشتری داشتند. میانگین اندازه ذات نانولیپوزوم عصاره چوچاق به طور محسوسی نسبت به سایر نمونه ها بالاتر (21/54 نانومتر) بود. فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره ها بعد از کپسولاسیون در نانولیپوزوم افزایش یافت. در میان باکتری ها استرپتوکوکوس اینیه و استافیلوکوکوس اورئوس به ترتیب در حضور نانولیپوزوم های حاوی عصاره چوچاق و زوفا، هاله ی عدم رشد بیشتری در مقایسه با سایر باکتریها از خود نشان دادند.

منافی دیزج یکان و همکاران (2018) به تولید نانولیپوزوم های خاوث عصاره برگ زیتون پرداختند. نتایج این مطالعه نشان داد که متوسط قطر حجمی ذرات لیپوزوم در محدوده 100 نانومتر بود. تمامی فرمولاسیون های لیپوزومی دارای بار منفی بودند و الحاق ترکیبات پلی فنولی موجب افزایش بار منفی ویزیکول گردید. بازده انکپسولاسیون نیز 78% گزارش شد.

[1] - Echinacea

[2] - Solid Lipid Nanoparticles

[3] - Sharma

[1] - Seaweed

[2] - Phaeophyta

[3] - Rhodophyta

[4] - Chlorophyta

بازده استخراج پروتئین جلبک توسط آنزیم های آلکالاز، تریپسین و پانکراسین چقدر است؟

امکان تولید نانولیپوزوم حاوی پپتید زیست فعال وجود دارد یا خیر؟

ویسکوزیته محلول پلیمری چقدر است؟

آیا هدایت الکتریکی محلول پلیمری مناسب می باشد؟

کشش سطحی و پتانسیل زتای محلول پلیمری چقدر است؟

آیا نوع انزیم بر خصوصیات آنتی اکسیدانی محلول پلیمری اثر دارد؟

آیا برهمکنش کافی بین اجزای سازنده نانولیپوزوم برقرار شده است؟

دمای انتقال شیشه ای و نقطه ذوب محلول پلیمری چقدر است؟

رهایش پپتید به محیط شبیه سازی شده معده و روده چگونه است؟

تولید ماست فراسودمند غنی شده با نانوحامل لیپوزومی حاوی بخش پپتیدی به دست آمده از جلبک گراسیلاریا کورتیکاتا

1. ارزیابی خصوصیات فیزیکی محلول­های پلیمری: اندازه گیری ویسکوزیته، هدایت الکتریکی، کشش سطحی، پتانسیل زتا و اندازه ذرات

2. ارزیابی اثر نوع آنزیم بر میزان محتوای فنول کل نانوکپسول تولیدی

3. ارزیابی اثر نوع آنزیم بر قدرت آنتی اکسیدانی نانوکپسول تولیدی

4. ارزیابی اثر نوع آنزیم بر می بازده ریزپوشانی زانی نانوکپسول تولیدی

5. تعیین ساختار نانوحامل با اسپکتروسکوپی مادون قرمز

6. ارزیابی روند حرارتی نانوحامل به روش DSC

7. ارزیابی رهایش پپتید از نانوحامل به داخل محیط شبیه سازی شده معده و روده

8. غنی سازی محصول لبنی (ماست) و بررسی ویژگی های فیزیکوشیمیایی آن

همکاران و مجری دوم طرح از سایر دانشگاه ها از جمله دانشگاه ملی اردان یزد و علوم پزشکی زابل می باشند.

نانولیپوزوم تولیدی جهت غنی سازی محصول لبنی به کار می رود. لذا در صورت موفقیت امی زبودن طرح امکان تولید ماست رژیمی وجود دارد

نانولیپوزوم: نانولیپوزوم­ها، ساختارهای خود تشکیل شونده­ای هستند که از کنار هم قرار گرفتن مولکول­های لیپیدی، در محلول آبی حاصل می­شوند .

پپتید: یکی از منابع مهم تولید ترکیبات زیست­فعال، پروتئین­ها می­باشند. پروتئین­ها علاوه بر­ داشتن کیفیت و ارزش غذایی، دارای فاکتورهای مهم دیگری منجمله مزایای عملکردی و سلامتی بخشی می­باشند. اما حساسیت و بی­ثباتی پروتئین­ها و ترکیبات مبتنی بر پروتئین به عوامل محیطی، حلالیت، محدودیت­های هضمی، وجود برخی از ترکیبات حساسیت زا و از بین رفتن ویژگی­های عملکردی در نتیجه واکنش با سایر ترکیبات، توانایی استفاده طبیعی از این ترکیبات را کاهش می­دهد

نوع مطالعه کاربردی می باشد و قابل بسط به صنعت مواد غذایی است

با توجه به اینکه این پژوهش بر روی جلبک دریایی صورت می گیرد و به منظور رفع مشکل جمع آوری جلبک در فصل مربوطه در دریای عمان، این جلبک از یک شرکت دانش بنیان که دارای حوضچه تهیه جلبک است خریداری خواهد شد. بدین منظور مقدار نمونه جلبک به دلیل حجم زیاد آزمایشات حدود 1 کیلوگرم خواهد بود.

حجم جلبک مورد استفاده حدود 2 کیلوگرم است که تخمین زده می شود از هر 100 گرم جلبک حدود 30 میلی گرم پپتید استخراج شود

با توجه به اینکه این پژوهش بر روی جلبک دریایی صورت می گیرد و به منظور رفع مشکل جمع آوری جلبک در فصل مربوطه در دریای عمان، این جلبک از یک شرکت دانش بنیان که دارای حوضچه تهیه جلبک است خریداری خواهد شد.

همه آزمایش‌ها در سه تکرار انجام خواهند شدند و داده‌ها به صورت انحراف استاندارد ± میانگین (mean ± SD) نشان داده می‌شوند. تجزیه و تحلیل واریانس یک طرفه (ANOVA) انجام خواهد شد و از آزمون چند دامنه ای دانکن برای تجزیه و تحلیل تفاوت معنی دار (p کم تر از 05/0) میانگین هر یک از مقادیر با استفاده از نرم افزار تجزیه و تحلیل آماری SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) انجام خواهد شد.

جمع­آوری جلبک و استخراج پپتیدهای زیست­فعال

جلبک مورد استفاده در این طرح از یک شرکت دانش بنیان در شهر شیراز که جلبک مورد مطالعه را شخصا در حوضچه پرورش می دهد و تمامی مراحل شستشو و ارزیابی دقیق توسط این شرکت جهت رفع هرگونه آلودگی را انجام می دهد خریداری شد. این شرکت به صورت شخصی حوضچه های جهت تولید این نمونه جلبک را نیز در اختیار دارد که جلبک تهیه شده از نمونه جلبک تولید شده توسط این شرکت می باشد. این شرکت تمام تاییده های استاندارد مورد نظر ایران را دارا می باشد. همچنین شایان ذکر است که فراورده های جلبک امروزه استانداردهای لازم جهت مصرف انسانی را کسب نموده اند و در تمامی داروخانه ها و محصولات آرایشی بهداشتی به وفور می توان این محصولات جلبکی خوراکی را مشاهده نمود. لذا از جهت اخذ مجوز لازم جهت بررسی مصرف ترکیبات زیست فعال جلبک ها توسط انسان نیاز به اخذ هیچگونه مجوزی از مراجع ذی صلاح نیست. در فاز مطالعاتی این طرح، جلبک مورد نظر از این شرکت دانش بنیان تهیه گردید که جای هیچگونه نگرانی در مورد آلودگی های جلبک و طریقه شستشوی آن مطرح نیست. ماکروجلبک مورد مطالعه پس از هماهنگی­های لازم از مرکز فروش جلبک در شیراز خریداری خواهد شد. این ماکرو جلبک در دمای محیطی خشک خواهند شد، سپس با آسیاب الکتریکی پودر خواهند شد.

هرچند جلبک تهیه شده طبق پروتکل های بهداشتی توسط شرکت دانش بنیان شستشو داده شده است ولی در کل مراحل شستشوی جلبک برای استخراج ترکیبات فعال و رفع آلودگی شامل مراحل زیر است:

الف) جمع‌آوری و آماده‌سازی: جلبک پس از خریداری در شرایط مناسب (مانند دمای 4 درجه سانتی‌گراد) نگهداری می شود.

ب)شستشو با آب: جلبک با آب مقطر شستشو داده شده تا ناخالصی‌های سطحی و ذرات معلق حذف گردد.

ج)شستشو با محلول اسیدی: برای حذف فلزات سنگین، جلبک با محلول اسیدی (مانند HCl یا HNO₃) با غلظت 1-1/0 درصد شستشو داده خواهد شد. این مرحله به مدت 30 دقیقه تا 1 ساعت انجام می‌شود.

د) شستشو با آب مقطر: پس از شستشو با محلول اسیدی، جلبک با آب مقطر شستشو داده شده تا اسید اضافی حذف شود.

آنالیز فلزات سنگین

پودر استخراج شده را با استفاده از روش‌های آنالیز (مانند اسپکتروسکوپی جذب اتمی) برای حضور فلزات سنگین (مانند سرب، جیوه، آرسنیک و کادمیوم) آنالیز مطابق با روش حیدری مجد و همکاران (2019) مورد انالیز قرار خواهد گرفت.

فاز 3 اجرایی(استخراج پروتئین)

استخراج پروتئین

به منظور چربی­زدایی، پودر خشک شده حاصل به نسبت 1:4 (وزنی/ حجمی) با هگزان مخلوط می‌شود و به مدت 3 ساعت در دمای اتاق همزده خواهد شد. سپس حلال هگزان با استفاده از قیف بوخنر جدا شده و پودر حاصل در دمای اتاق خشک می­گردد و از الک با مش 40 عبور داده خواهد شد. عملیات استخراج پروتئین از پودر چربی زدایی شده به این صورت خواهد بود که پودر جلبک به نسبت 1:10 با محلول 33/0مولار نمک طعام، 25/9pH= مخلوط می­شود و به مدت 2 ساعت همزده خواهد شد، سپس محلول حاصل در دور g 4500 به مدت 30 دقیقه سانتریفوژ خواهد شد. در مرحله بعد pH سوپرناتانت در 5/4pH= (pH ایزوالکتریک) تنظیم خواهد شد. سپس در جهت رسوب پروتئین‌ها، محلول حاصل در دور g 4500 به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ می‌شود. در ادامه رسوب پروتئین با آب مقطر، دو بار شسته شده و در دور g 4500، به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ می‌شود و با تنظیم2/7pH = با افزودن سود 1 مولار، دوباره به حالت محلول تبدیل خواهد شد. سپس ایزوله پروتئین حاصل با خشک کن انجمادی، خشک شده و در دمای C°4 نگهداری می‌شود. تمامی فرآیندها در دمای اتاق انجام می­شود (Feyzi et al., 2015).

فاز 4 اجرایی(تهیه ترکیب زیست فعال مورد نظر با استفاده از هیدرولیز آنزیمی)

تولید پپتید

ایزوله‌ی پروتئین جلبک جهت انجام هیدرولیز با سه آنزیم آلکالاز، تریپسین و پانکراسین در ارلن‌های حجمی توزین و در بافر فسفات (10pH=، mM 10) و در غلظت 5% وزنی-حجمی مخلوط و امکان هیدراته شدن آن در حین همزدن مداوم به مدت 30 دقیقه و در دمای محیط مهیاء می‌شود. pH مخلوط با استفاده از هیدروکسید سدیم جهت عمل آنزیم به 8/7 تنظیم می‌شود. غلظت آنزیم 2% (وزنی/وزنی) می‌باشد. برای غیرفعال سازی آنزیم، مخلوط به مدت 15 دقیقه در دمای °C90، حرارت داده می‌شود. سوسپانسیون حاصل در دمای محیط خنک، به روش انجمادی خشک و تا زمان استفاده در دمای 20- درجه نگهداری خواهد شد (Adjonu et al., 2014).

فاز 5 اجرایی(تهیه نانواحامل حاوی ترکیب زیست فعال)

تولید نانوحامل­های لیپوزوم و آزمون­های مربوطه

از روش هیدراسیون لایه نازک به منظور تولید نانوحامل لیپوزومی حاوی پپتید زیست­فعال ماکروجلبک استفاده خواهد شد (هوانگ[1] و همکاران، 2013). برای این منظور، 400 میلی گرم لستین توزین و در یک ظرف آزمایشگاهی قرار خواهد گرفت.سپس 20 میلی لیتر کلروفرم به لستین اضافه خواهد شد. محتویات به خوبی مخلوط و کلروفرم با استفاده از یک دستگاه تبخیر کننده در دمای ^°C 40 تحت خلاء جدا خواهد شد. مرحله جداسازی حلال تا جایی ادامه می­یابد که یک فیلم نازک در ته بالن تشکیل شود. محلول نمک بافر فسفات (4/7 pH) حاوی مقادیر پپتید زیست­فعال به فیلم نازک اضافه خواهد شد تا کاملاً هیدراته شود. در این مرحله لیپوزوم­های چند لایه بدست خواهند آمد. جهت بدست آمدن لیپوزوم­های تک لایه کوچک و یکنواخت، دیسپرسیون بدست آمده تحت امواج فراصوت (اولتراسوند مجهز به حمام آب) قرار خواهد گرفت. پپتید زیست­فعال در محلول رویی باقی مانده و از این رو با لیپوزوم­های پایین جدا می­شود.

اندازه ذرات و پتانسیل زتا

اندازه ذرات و پتانسیل زتا توسط پراکنش نور پویا با استفاده از تجزیه و تحلیل اندازه ذرات اندازه­گیری خواهد شد. برای این منظور، محلول نانوحامل با آب مقطر دوبار تقطیر به نسبت 1 به 10 مخلوط می­شود. قطر میانگین و پراکندگی اندازه ذرات در سه تکرار اندازه گیری می شود. پتانسیل زتا نیز در سه تکرار و در دمای محیطی توسط پراکندگی نور اندازه­گیری خواهد شد (Pimentel-Moral et al., 2019).

بررسی هدایت الکتریکی

اساس روش هدایت­ سنجی تعیین مقاومت الکتریکی یک محلول در مقابل عبور جریان الکتریسیته از آن است. برای بررسی هدایت الکتریکی محلول‌ها از دستگاه هدایت سنج استفاده می‌شود. هدایت الکتریکی محلول، با اعمال ولتاژی حدود ۶ ولت بین دوالکترود یکسان پلاتینی که با لایه نازکی از پلاتین پوشش داده شده است، اندازه ‏گیری خواهد شد (Rezaeinia et al., 2020).

اندازه گیری کشش سطحی

با اندازه گیری کشش سطحی  مایعات می­توان میزان تعامل مایع با سطح را مشخص کرد. اندازه  گیری کشش سطحی می­تواند در تعیین میزان چسبندگی مایعات به سطوح دیگر را  مشخص کند. برای بررسی کشش سطحی محلول ها در دمای ^°C 20 از دستگاه تنشیومتر استفاده می‌شود. برای کالیبر نمودن دستگاه نیز از آب مقطر (mN/m 64/71) استفاده خواهد شد (Rezaeinia et al., 2020).

بررسی ویسکوزیته محلول

زمانی که با یک سیال ویسکوز یا ویسکوالاستیک سر و کار داریم، می‌بایست اطلاعاتی در مورد رفتار رئولوژیکی آن بدانیم. این اطلاعات برای تصمیم گیری‌های مناسب در انتخاب شرایط فرایندی و یا شرایط کاربری لازم می‌باشند. یکی از مشخصه‌های رفتار رئولوژیکی، رابطه تنش و یا ویسکوزیته با سرعت برش می‌باشد. بدین معنا که می‌بایست منحنی جریان را در مقادیر مختلف از سرعت برش به دست آوریم. برای بررسی ویسکوزیته محلول از ویسکومتر بروکفیلد استفاده می‌شود. تمامی آزمایش ها در سه تکرار و با رنج نیروی برشی 1 تا S^-1 82 و در دمای محیطی انجام خواهد شد. داده­های رئولوژیکی به دست آمده با استفاده از مدل­های قانون توان[2] و هرشل-بالکلی[3] برازش خواهد شد (Rezaeinia et al., 2020):

بررسی بازده درون­پوشانی

بدین منظور ابتدا، ml 2 از هر یک از نمونه­های تازه آماده شده به فیلتر فوق سانتریفیوژ 167 آمیکون منتقل و در دور g 3000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ خواهد شد. سپس مقدار پپتیدهای عبوری از فیلتر (پپتیدهای آزاد) با روش بردفورد (1976) تعیین خواهد شد (Bradford, 1976).در نهایت، بازده درون­پوشانی از طریق محاسبه غلظت پروتئین بارگذاری شده در نانولیپوزوم­ها به کل پروتئین (به درصد) محاسبه خواهد شد.

قدرت آنتی اکسیدانی

محتوای فنول کل و قدرت آنتی اکسیدانی توسط روش حیدری مجد و همکاران (2019) (Heydari-Majd et al., 2019) اندازه گیری خواهد شد. μl 40 از پودر نانوحامل با ml 32/2 آب مقطر و μl200 محلول فولین مخلوط خواهد شد. بعد از گذشت min 5، μl600 از محلول 20% کربنات سدیم به مخلوط قبلی اضافه می شود و در دمای محیطی به مدت min 30 نگهداری خواهد شد. سپس جذب در nm 760 اندازه گیری می شود. از اسید گالیک به عنوان استاندارد ترکیبات فنولی استفاده خواهد شد.

آزمون بازدارندگی رادیکال های آزاد: با اندازه گیری و تعیین شاخص (IC₅₀[4]) و غلظتی از اسانس که قادر است نیمی از رادیکال های آزاد موجود در معرف دی فنیل پیکریل هیدرازین[5] را پوشش دهد مقایسه انجام می شود. در غلظتی مشخص از اسانس، هر کدام به شاخص (IC₅₀) می رسد کمتر باشد قدرت آنتی اکسیدانی بهتری دارند (Salarbashi et al, 2013). برای انجام آزمون، نمونه حامل در ۵ میلی لیتر آب مقطر حل شده و محلول حامل در غلظت های مختلف (mg/l ۲۰۰۰۰-۴۰۰۰) ساخته می شود. سپس محلول رقیق شده با ۹/۳ میلی لیتر محلول متانولی ۱/۰ میلی مولار DPPH مخلوط می شود. مخلوط با یک میکسر هم زده شده و در تاریکی و در دمای محیط به مدت ۶۰ دقیقه نگهداری می شود. جذب در ۵۱۷ نانومتر خوانده شده و درصد مهارکندگی رادیکال های آزاد طبق معادله ذیل محاسبه می گردد(Salarbashi et al, 2013) :

در این معادله: Abs_DPPH : مقدار جذب در ۵۱۷ نانومتر برای محلول متانولیکی DPPH، Abs_extract: مقدار جذب در ۵۱۷ نانومتر برای نمونه می باشد. مقدار مهارکنندگی رادیکال های آزاد تحت عنوان ارزش IC₅₀ بیان می گردد. این ارزش معادل با غلظت مورد نیاز برای مهار ۵۰٪ رادیکال های آزاد می باشد. درصد مهار رادیکال های آزاد در برابر غلظت پپتید رسم شده و غلظت مورد نیاز برای مهار ۵۰٪ رادیکال های آزاد توسط رگریسیون خطی به دست می آید.

قدرت احیاءکنندگی

برای قدرت احیاءکنندگی از 5/0 میلی لیتر محلول نمونه (حاویmg/ml40) با 5/2 میلی لیتر بافرفسفات M 2/0، (6/6pH=) و 5/2 میلی لیتر پتاسیم فری سیانید %1 مخلوط می‌شود. مخلوط در دمای°C50، به‌مدت 20 دقیقه انکوبه می‌شود. 5/2 میلی لیتر محلول تری کلرو استیک اسید %10 به مخلوط اضافه و به مدت 10 دقیقه در g× 3000 سانتریفوژ می‌شود. 5/2 میلی‌لیتر از محلول فوقانی با 5/2 میلی‌لیتر آب مقطر و 5/2 میلی‌لیتر کلرید آهن %1/0 مخلوط می‌شود. جذب نمونه در 700 نانومتر خوانده می‌شود. افزایش جذب مخلوط واکنش نشان دهنده افزایش قدرت احیاءکنندگی است (احمدی و همکاران،2007).

فعالیت شلاته کنندگی فلزات

برای تعیین فعالیت شلاته‌کنندگی یون آهن، 1 میلی‌لیتر محلول نمونه (حاویmg/ml40) با 7/3 میلی‌لیتر آب مقطر مخلوط می‌شود. مخلوط با 1/0 میلی‌لیترmMFeCl₂2و 2/0 میلی‌لیترفروزینMm5، به‌مدت 20 دقیقه در دمای اتاق واکنش می‌دهد. جذب در 562 نانومتر خوانده می‌شود. برای نمونه کنترل هم تمام مراحل فوق انجام به جز اینکه از آب مقطر به جای محلول حاوی نمونه استفاده می‌شود. فعالیت شلاته کنندگی با استفاده از فرمول زیر محاسبه می‌شود ( دکر و ولچ، 1990):

میکروسکوپ الکترونی (TEM)

تعیین خصوصیات مورفولوژیکی و ساختاری حامل ها و مشاهده نحوه پراکنش پپتید در داخل آن با استفاده از TEM انجام خواهد شد. نمونه ها در اندازه های mm۱ × mm۵ بریده و با لایه ای از طلا پوشانده خواهند شد. از سیستم تحلیل تصویری با شتاب ولتاژ kV۲۰ استفاده می شود (Ojagh et al., 2010).

طیف سنجی فرو سرخ:

این آزمون بر روی حامل به منظور بررسی تشکیل پیوند در فرکانس بین 400 cm^-1 تا 4000 cm^-1 با وضوح 4 cm^-1 توسط دستگاه طیف سنج مادون قرمز تبدیل فوریه مدل (Jasco-680) انجام خواهد شد. برای این منظور در ابتدا نمونه مورد نظر با کمک نیتروژن مایع و با استفاده از یک هاون چینی به صورت پودر در آورده می شود. نمونه پودر با پودر پتاسیم-بروماید (KBr) مخلوط شده و به شکل قرص در محفظه کوچک دستگاه قرار میگرد و در فرکانس ذکر شده مورد آنالیز قرار خواهد گرفت(Heydari-Majd et al., 2019) .

بررسی خصوصیات حرارتی فیلم های تولید شده

برای این منظور از دستگاه کالریمتری اسکنی افتراقی (DSC) با سرعت ^°C۱۰ در دقیقه و در گستره دمایی ۵۰- تا ^°C۲۰۰ و اندازه گیری نقطه ذوب (T_m) و دمای انتقال شیشه ای(T_g) حامل های تولیدی از روی ترموگرام استفاده خواهد شد ((Heydari-Majd et al., 2019)). دمای انتقال شیشه ای به عنوان نقطه وسط شروع و پایان تغییرات منحنی در جریان گرمایی در نظر گرفته شد.

فاز 6 اجرایی(بررسی رهایش ترکیبات زیست فعال در محیط بدن انسان)

آزمون های مربوط به رهایش پپتید

رهایش پپتید به داخل شبه غذا: برای این منظور از اتانول ۲۰٪ به عنوان شبه نوشیدنی های الکلی استفاده خواهد شد. در ابتدا نمونه های حامل تهیه شده توسط اتانول جهت حذف هرگونه آلودگی سطحی شسته می شوند. جهت انجام آزمون رهایش، یک تیوپ ۵۰ میلی لیتری به عنوان پیل مهاجرت تهیه شده و نانوحامل در درون آن قرار خواهد گرفت. ظرف ها با ۴۰ میلی لیتر اتانول ۲۰٪ پر خواهد شد و در دمای ^°C۲۰ برای مدت ۱۰ روز قرار می گیرند. در نهایت غلظت پپتید در حلال توسط اسپکتروفتومتر اندازه گیری می شود. برای بررسی سنتیک رهایش پپتید از قانون توان[6] و مدل ویبول[7] و همچنین جهت اندازه گیری پارامتر ضریب انتشار از رابطه کرانک[8] که یکی از مهمترین مدل های پیش بینی کننده مهاجرت است استفاده خواهد شد.

آنالیز حسی ماست غنی شده با نانولیپوزوم­های حاوی پپتید زیست­فعال

ارزیابی حسی توسط 20 پانلیست آموزش دیده انجام خواهد شد. ارزیابی هدونیک 7 نقطه ای با نمرات 1 (خیلی بد) تا 7 (خیلی خوب) استفاده خواهد شد. شاخص­های حسی برای رنگ، طعم، بافت و پذیرش کلی در نظر گرفته خواهد شد (Hosseini et al., 2015).

فاز 7 اجرایی(غنی سازی محصول لبنی (ماست) با استفاده از نانوحامل حاوی ترکیب زیست فعال)

بررسی کارایی نانوحامل­ها در محیط­های واقعی (ماست)

برای این منظور از روش Tavakoli و همکاران (2018) استفاده خواهد شد. در ابتدا شیر پاستوریزه از شرکت مربوطه خریداری خواهد شد. شیر پس از پاستوریزاسیون تا دمای ^°C 42 سرد خواهد شد و سپس کشت استارتر تجاری در غلظت 5% (وزنی/حجمی) به شیر پاستوریزه اضافه می­شود. در ادامه این شیر به مدت 3 ساعت در دمای ^°C 41 گرمخانه­گذاری خواهد شد. بعد از این فرآیند، این محصول به مدت 24 ساعت در یخچال نگهداری می­شود. سپس 15 گرم نانولیپوزوم حاوی غلظت­های مختلف پپتید زیست­فعال و همچنین نمونه کنترل (پپتید زیست­فعال درون­پوشانی نشده) به 100 گرم ماست اضافه شده و در دمای ^°C 4 در یخچال نگهداری می­شود. ویژگی­های ماست غنی شده در یک بازه زمانی 21 روزه بررسی خواهد شد.

ارزیابی فعالیت آنتی­اکسیدانی ماست غنی شده با نانولیپوزوم­های حاوی پپتید زیست­فعال

در ابتدا 5/2 میلی­لیتر آب مقطر با 10 گرم ماست ( pH آن توسط اسید کلریدریک 1 مولار بر روی 4 تنظیم شده است) اضافه و همزده می­شود. سپس این ماست در دمای ^°C 45 به مدت 10 دقیقه گرم­خانه­گذاری می­شود و در ادامه با سرعت g 10000 به مدت 10 دقیقه در دمای ^°C 4 سانتریفوژ می­شود. محلول رویی جدا شده و توسط سود بر روی 7 pH تنظیم می­شود. عمل سانتریفوژ مجددا با همان شرایط قبلی انجام شده و حدود 20 میکرولیتر از نمونه به 3 میلی لیتر محلول اتانولی DPPH (60 میکرو مولار) اضافه شده و پیوسته همزده خواهد شد. محلول به­دست آمده سپس به مدت 5 دقیقه در دمای محیطی نگهداری شده و سپس جذب (A_extract) در 517 نانومتر قرآئت خواهد شد (Shori and Baba, 2014). در نمونه کنترل (A_control) از آب مقطر بجای ماست غنی شده استفاده خواهد شد. در پایان فعالیت آنتی­اکسیدانی محاسبه خواهد شد.

ارزیابی pH و اسیدیته ماست غنی شده با نانولیپوزوم­های حاوی پپتید زیست­فعال

برای این منظور ابتدا 10 میلی­لیتر ماست غنی­شده در یک ظرف حاوی 10 میلی­لیتر ریخته شده و پس از هم زدن، الکترود pH-متر در طرف نمونه گذاشته شده و مقدار pH قرآئت می­گردد. برای اندازه گیری اسیدیته، 9 گرم نمونه ماست غنی­شده در داخل یک ظرف ریخته شده و به مقدار هم وزن آن آب مقطر ریخته می­شود. سپس این مخلوط توسط سود 1/0 نرمال و فنول فتالئین 1% تیتر شده تا یک رنگ صورتی پایدار ایجاد گردد. اسیدته (بر حسب اسید لاکتیک) از تقسیم حجم سود مصرفی بر عدد 10 به­دست خواهد آمد (Shori and Baba, 2014

تحلیل قیمت تمام شده نمونه اولیه

جدول هزینه تمام شده محصول برای یک ماست 250 گرمی معمولی با قیمت تقریبی 500/47 تومان

• 100 گرم جلبک = 500 هزار تومان، 1 گرم جلبک = 5 هزار تومان

• 1 گرم جلبک = 300 میلی گرم پپتید (mg 25 × 12).

• نانولیپوزوم تولیدی (5 میلی گرم پپتید در یک گرم (سی سی) کلسترول). نانولیپوزوم حاوی 5 میلی گرم پپتید به 25 سی سی ماست اضافه می شود و لذا برای ماست 250 سی سی حدود 25 میلی گرم پپتید و 12 گرم کلسترول مصرف می شود.

• 300 گرم لستین = 300 هزار تومان، 1 گرم لستین = 1000 تومان.

• 1 گرم آنزیم = 200 هزار تومان، مقدار مصرف آنزیم 1% مقدار جلبک می باشد. لذا 1 گرم جلبک حدود 01/0 گرم آنزیم نیاز دارد و با توجه به قیمت آنزیم می توان بیان داشت که: 1 گرم جلبک = 200 تومان آنزیم.

• هر آزمون فریز درایر مبلغ 300 هزار تومان است که امکان خشک کردن 300 گرم پودر را دارا می باشد. لذا هر 1 گرم پودر حدود 1000 تومان برای خشک شدن نیاز دارد.

با توجه به جدول فوق قیمت یک ماست 250 گرمی با مبلغ 47500 تومان بعد از غنی سازی در حدود 53100 تومان خواهد بود.).

[1] - Hwang

[2] - Power law

[3] - Herschel–Bulkley

[4] - Concentration of the sample required to inhibit 50% of radical

[5] - 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)

[6] - Power Law

[7] - Weibull Model

[8] - Crank Model

همه آزمایش‌ها در سه تکرار انجام خواهند شدند و داده‌ها به صورت انحراف استاندارد ± میانگین (mean ± SD) نشان داده می‌شوند. تجزیه و تحلیل واریانس یک طرفه (ANOVA) انجام خواهد شد و از آزمون چند دامنه ای دانکن برای تجزیه و تحلیل تفاوت معنی دار (p کم تر از 05/0) میانگین هر یک از مقادیر با استفاده از نرم افزار تجزیه و تحلیل آماری SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) انجام خواهد شد.

طرح بایستی کد اخلاق جهت درج در مقاله کسب نماید. لاحظه اخلاقی خاصی وجود ندارد.

متغیر مستقل این پژوهش نوع انزیم است که با توجه وجود آنزیم های هیدرولیز کننده با برندهای مختلف در بازار ایران و در صورت وجود ناخالصی در این آنزیم ها امکان استخراج کامل پپتید وجود نخواهد داشت و بازده اندازه گیری درست نخواهد بود که برای رفع ای مشکل آنزیم مارک مرک از کشور ترکیه سفارش داده شده و در مرز ایران تحویل یکی از محققین این طرح شد. مورد دیگر نوع لستین استفاده شده در تهیه لیپوزوم می باشد که لیستین های فروشی کارانه های روغن اکثرا ناخالص هستند که این امر باعث تهیه یک لیپوزوم نامناسب می شود و حتی امکان ایجاد پیک های نامربوط در آزمون ftir و ایجاد خطا در کار شود که برای رفع این مشکل هم لستین مارک مرک از یکی از معتبرترین شرکت های فروش مواد شیمیایی خریداری گردید.محدودیت خاصی موجود نیست. مشکل فقط نوسانات دلاری است که امکان ایجاد هزینه بیشتر را برای طرح ایجاب می نماید

جلبک، پپتید، نانولیپوزوم، ماست رژیمی

Adjonu, R., Doran, G., Torley, P., Agboola, S. (2014). Whey protein peptides as components of nanoemulsions: A review of emulsifying and biological functionalities. Journal of Food Engineering. 122, 15-27.

Aluko, R. E., & Monu, E. (2003). Functional and bioactive properties of quinoa seed protein hydrolysates. Journal of Food Science, 68(4), 1254-1258.

Bradford, M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72 (1), 248-254.

Feyzi, S., Varidi, M., Zare, F., Varidi, M. (2015). Fenugreek (Trigonella foenum graecum) seed protein isolate: extraction optimization, amino acid composition, thermo and functional properties. Journal of the Science of Food and Agriculture. 98(15), 3165-3176.

García-Morales, J., Fimbres-Olivarría, D., González-Vega, R. I., Bernal-Mercado, A. T., Aubourg-Martínez, S. P., López-Gastélum, K. A., ... & Del-Toro-Sánchez, C. L. (2025). Nanoliposomes as Effective Vehicles of Antioxidant Compounds in Food and Health. International Journal of Molecular Sciences, 26(12), 5523.

Heydari-Majd, M., Rezaeinia, H., Shadan, M., Ghorani, B., Tucker, Nick (2019). Enrichment of zein nanofibre assemblies for therapeutic delivery of Barije (Ferula gummosa Boiss) essential oil. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 54, 101290.

Hosseini, A., Jafari, S., Mirzaei, H., Asghari, A., Akhavan, S., (2015). Application of image processing to assess emulsion stability and emulsification properties of Arabic gum. Carbohydrate polymers. 126, 1-8.

Hwang, J-M., Kuo, H-Ch., Lin, Ch-T., Kao, E-Sh. (2013). Inhibitory effect of liposome-encapsulated anthocyanin on melanogenesis in human melanocytes. Pharmaceutical biology. 51(8), 941-947.

Jamdar, S. N., Rajalakshmi, V., Pednekar, M. D., Juan, F., Yardi, V., & Sharma, A. (2010). Influence of degree of hydrolysis on functional properties, antioxidant activity and ACE inhibitory activity of peanut protein hydrolysate. Food chemistry, 121(1), 178-184.

Khan, F., Niaz, K., & Abdollahi, M. (2018). Toxicity of biologically active peptides and future safety aspects: an update. Current drug discovery technologies, 15(3), 236-242.

Kirby, C. (1991). Microencapsulation and controlled delivery of food ingredients. Food Science and Technology Today, 5, 74-8.

Li, Z., Paulson, A. T. Gill, T. A. (2015). Encapsulation of bioactive salmon protein hydrolysates with chitosan-coated liposomes. Journal of Functional Foods. 19, 733- 743.

Pimentel-Moral, S., Teixeira, MC., Fernandes, AR., Borrás-Linares, I., Arráez-Román, D., Martínez-Férez, A., Segura-Carretero, A., Souto, E. (2019). Polyphenols-enriched Hibiscus sabdariffa extract-loaded nanostructured lipid carriers (NLC): Optimization by multi-response surface methodology. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 49, 660-667.

Ramezanzade, L., Hosseini, S. F., & Nikkhah, M. (2017). Biopolymer-coated nanoliposomes as carriers of rainbow trout skin-derived antioxidant peptides. Food Chemistry, 234, 220-229.

Rao, D. R., Chawan, C. B., & Veeramachaneni, R. (1994). Liposomal encapsulation of β‐galactosidase: comparison of two methods of encapsulation and in vitro lactose digestibility. Journal of food biochemistry, 18(4), 239-251.

Rezaeinia, H., Emadzadeh, B., Ghorani, B. (2020). Electrospun balangu (Lallemantia royleana) hydrocolloid nanofiber mat as a fast-dissolving carrier for bergamot essential oil. Food Hydrocolloids. 100, 105312.

Rosemary, T., Arulkumar, A., Paramasivam, S., Mondragon-Portocarrero, A., Miranda, J. (2019). Biochemical, micronutrient and physicochemical properties of the dried red seaweeds Gracilaria edulis and Gracilaria corticate. Molecules. 24(12). 2225.

Savaghebi, D., Barzegar, M., Mozafari, M. (2020). Manufacturing of nanoliposomal extract from Sargassum boveanum algae and investigating its release behavior and antioxidant activity. Food science & nutrition. 8(1), 299-310.

Thompson, A. K. (2003). Liposomes: from concepts to applications. Food and beverage from New Zealand‌.13, 23-32.

Maqsoudlou, A., Sadeghi Mahoonak, A., Mora, L., Mohebodini, H., Toldrá, F., Ghorbani, M. (2018). Peptide identification in alcalase hydrolysated pollen and comparison of its bioactivity with royal jelly. Food Research International. 88, 963- 974.

Nalinanon, S., Benjakul, S., Kishimura, H., & Shahidi, F. (2011). Functionalities and antioxidant properties of protein hydrolysates from the muscle of ornate threadfin bream treated with pepsin from skipjack tuna. Food chemistry, 124(4), 1354-1362.

Xie, J., Du, M., Shen, M., Wu, T., Lin, L. (2019). Physico-chemical properties, antioxidant activities and angiotensin-I converting enzyme inhibitory of protein hydrolysates from Mung bean (Vigna radiate). Food chemistry. 270, 243-250.

Yu, W., Field, C., Wu, J., (2018). Purification and identification of anti-inflammatory peptides from spent hen muscle proteins hydrolysate. Food chemistry. 253, 101-107.

پرسشنامه مربوط به این طرح نیست و این طرح به صورت آزمایشگاهی انجام خواهد شد